Регрессия как этап развития - А. Крылов

Мы исследовали инструментальный навык касания рычага для получения воды правой или левой вибриссной подушкой животными, находящимися в условиях водной депривации. Известно, что нейроны бочонкового поля соматосенсорной коры активируются при использовании грызунами вибрисс (Harris et al., 1999). Вовлечение нейронов в процессы аккомодационной реконсолидации при формировании второго навыка может быть оценено по индукции в нейронах экспрессии транскрипционного фактора – белка с-Fos (продукта экспрессии раннего гена c-fos), поскольку известно, что индукция экспрессии раннего гена c-fos происходит при обучении и что распределение Fos-положительных нейронов связано с тем, какое поведение приобретается (см., напр.: Анохин, 1997).

Контролируя процесс обучения животных, мы в определенной степени «задавали» историю формирования их индивидуального опыта. Поэтому, последовательно обучая животных двум навыкам, мы могли выявить закономерности активации нейронов первого навыка при формировании второго. Было установлено, что обучение второму, пищедобывательному навыку (не требующему использования вибрисс) вызывает экспрессию с-Fos в достоверно большем числе нейронов бочонкового поля у животных, предварительно обучавшихся инструментальному питьевому («вибриссному») навыку, чем в аналогичной области у контрольных животных, обучавшихся предварительно неинструментальному питьевому навыку (Сварник и др., 2014). Полученные данные позволяют предположить, что активация экспрессии c-Fos при обучении второму навыку происходила не только в новых, еще не специализированных нейронах, но и в тех нейронах, которые уже являлись специализированными относительно системы первого, «вибриссного» навыка, что, вероятно, указывает на происходящий процесс реконсолидации сформированной функциональной системы.

Мы предположили, что при введении животным алкоголя в процессе формирования второго, невибриссного навыка будет обнаружена экспрессия белка c-Fos в нейронах бочонкового поля соматосенсорной коры того полушария, которое является контралатеральным по отношению к вибриссной подушке, использованной во время формирования первого навыка. Это будет свидетельствовать в пользу того, что элемент индивидуального опыта данного навыка реактивируется как при введении, так и без введения алкоголя. Если это так, то как отличаются реактивации в двух сравниваемых ситуациях, одна из которых связана с угнетением активности нейронов недавно сформированных систем?

Для проверки данного предположения и ответа на сформулированный вопрос животных (крысы Long Evans в возрасте 6–8 мес., содержавшиеся в индивидуальных клетках размером 40×25×20 см, расположенных в виварии) последовательно обучали в экспериментальной камере двум навыкам: питьевому и пищевому. Инструментальное питьевое поведение заключалось в том, что животное должно было проводить вибриссной подушкой (только левой или только правой) по краю рычага для получения порции воды в размере 20–30 мкл. Обучение данному виду поведения (на фоне питьевой депривации) проходило поэтапно в течение пяти дней (30-минутные ежедневные сессии). В первый день животные получали подкрепление за нахождение рядом с поилкой, во второй – за поворот головы в сторону педали, в третий – за полный поворот тела в сторону педали, в четвертый – за подход к педали. На последнем (пятом) этапе крыса обучалась касаться рычага вибриссной подушкой для получения порции воды. Весь период обучения длился 11 дней, в течение которых все животные обучились питьевому инструментальному навыку. Животные реализовывали приобретенный навык питьевого поведения в течение еще пяти дней. За 24 ч до сессии с ледующего (пищевого) обу чения у животных забирали корм из домашней клетки для создания пищевой мотивации. Несмотря на то, что животные в течение всего периода первого этапа обучения (питьевое инструментальное поведение) находились на питьевой депривации, а в течение второго этапа обучения (пищевое инструментальное поведение) – на пищевой депривации, потери в весе на период обучения не составили более 20 %. Для адаптации к условиям следующего этапа обучения животные в течение 5 дней до его начала на 5 минут в день помещались в новую экспериментальную клетку, где им предстояло обучиться пищевому невибриссному навыку.

В последний экспериментальный день после интраперитониальной инъекции алкоголя (этанола; 0,5 г/кг) животных помещали на 30 мин в экспериментальную клетку, содержащую педаль и кормушку, для обучения пищедобывательному навыку нажатия лапами на педаль. Нажатие на педаль приводило к появлению порции пищи в кормушке (кубик сыра). Данное пищевое поведение не требовало использования вибрисс как условия достижения результата (в отличие от питьевого поведения, приобретенного ранее). Видеозапись поведения осуществлялась на цифровую видеокамеру, закрепленную на верхней стороне экспериментальной клетки пищедобывательного навыка. Анализ видеозаписи поведения был осуществлен с использованием программы Easy Track, которая позволяет оценивать поведение животного в «зонах интереса». В качестве таковых было выбрано четыре зоны: зона эффективной кормушки, зона эффективной педали, зона неэффективной кормушки, зона неэффективной педали.

Через 75 минут после окончания сессии обучения пищедобывательному навыку животных усыпляли ингаляционным наркозом (эфиром), мозг извлекали и замораживали в парах жидкого азота. Животные группы пассивного контроля были взяты из домашней клетки вивария непосредственно перед извлечением мозга.

Для оценки распределения с-Fos-положительных нейронов в головном мозге были проанализированы бочонковое поле соматосенсорной коры (поскольку известно, что нейроны данной области активируются при использовании грызунами вибрисс), а также ретросплениальная кора, в которой, как нам известно (см.: Горкин, Шевченко, 1995; Александров, 2011б; Александров и др., 2015; Alexandrov et al., 1990а, 1991, 2000; Gavrilov et al., 1998; Svarnik et al., 2005), большой процент нейронов у крыс специализируется относительно пищедобывательного акта инструментального поведения – нажатия на педаль. Анализ распределения Fos-положительных нейронов проводился на фронтальных криостатных 20-микронных срезах головного мозга крыс. Срезы брались с шагом в 80 микрон на уровне 3,36–4,36 от брегмы, что позволило в дальнейшем анализировать соматосенсорную и ретросплениальную кору (Paxinos, Watson, 2009). После фиксации в 4-процентном параформальдегиде и промывки срезы предынкубировались в фосфатном буфере с добавлением 2,5-процентной нормальной сыворотки для снижения неспецифического окрашивания. Выявление индукции экспрессии с-Fos проводилось иммунногистохимически, в соответствии с протоколом стрептавидин-биотин-пироксидазного иммунногистохимического набора (Vectastain Elite ABC KIT, Vector, USA). Для реакции были использованы поликлональные кроличьи антитела к c-Fos (AB-5, Oncogene Science, USA) в разведении 1: 2000 (см.: Сварник и др., 2014). После появления окраски стекла были дегидратидированы проведением через серию спиртов восходящей концентрации и ксилол, а затем заключены под покровные стекла.

Срезы оцифровывались при 10-кратном увеличении на микроскопе Olympus V-110 с помощью высокоразрешающей CCD камеры (Nikon DMX-1200) и вводились в компьютер для анализа распределения иммунопозитивных клеток в мозге. Окрашенные клетки в исследуемых областях мозга были подсчитаны на компьютере с помощью морфометрической программы Image Pro 3.0.

В описываемых здесь экспериментах с введением алкоголя было выявлено, что при формировании второго, пищедобывательного навыка введение алкоголя «блокирует» реактивацию (по белку c-Fos) нейронов систем первого, питьевого навыка. Число Fos-положительных нейронов в контралатеральном бочонковом поле при обучении второму навыку под воздействием алкоголя оказалось достоверно меньшим, чем в ситуации без алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,72; p = 0,006; величина эффекта (effect size) r = 0,79) (см. рисунок 3). Кроме того, животные, находящиеся под влиянием алкоголя, были менее активны, чем животные, не находящиеся под влиянием алкоголя (U Манна – Уитни, z = 2,32, p = 0,02; величина эффекта r = 0,67), что выражалось как в снижении общей длины трека и общей длительности двигательной активности, так и в снижении средней скорости передвижения. Общий паттерн распределения нейрогенетических изменений в коре головного мозга под воздействием алкоголя и без него оказался одинаковым. Но при этом в целом под воздействием алкоголя число активированных нейронов в корковых структурах головного мозга оказалось в разы меньшим, чем без этого воздействия (U Манна – Уитни, p<0,01 для обеих проанализированных структур в обоих полушариях (на рисунке 3 обозначено звездочкой); величина эффекта r = 0,83 для ретросплениальной коры контралатерального полушария относительно используемой вибриссной подушки, r = 0,81 для ретросплениальной коры ипсилатерального полушария; r = 0,79 для бочонкового поля контралатерального полушария, r = 0,83 для бочонкового поля ипсилатерального полушария), что соответствует данным литературы (напр.: Lu et al., 2014).