Цитология - Наталья Стволинская
Шрифт:
Интервал:
Закладка:
С помощью этого метода впервые в клетках были открыты лизосомы – небольшие вакуоли, содержащие гидролитические ферменты и выполняющие пищеварительные функции в клетках. После открытия лизосом методом фракционирования, их обнаружили на срезах клеток под световым и электронным микроскопом с помощью метода цитохимии, выявив работу специфических ферментов.
Возможность получения чистых фракций отдельных органоидов позволила изучить их химический состав, набор ферментов и, в конечном итоге, понять, как работает та или иная клеточная структура.
Вопросы
1. Что такое гомогенизация клеток?
2. Почему разные органоиды клетки при центрифугировании осаждаются на дно не одновременно?
3. Какие клеточные органоиды были открыты именно с помощью метода фракционирования клеток?
Метод клеточных культур
Обычно лаборатории, занимающиеся изучением биологии клетки, имеют в своем арсенале несколько методов. Метод клеточных культур обязательно есть в их числе.
В начале XX в. французский ученый А. Каррель установил, что в асептических условиях клетки многоклеточного организма могут расти в искусственной питательной среде в течение длительного времени. В настоящее время известно, что большинство видов клеток растений и животных в благоприятных условиях способны не только жить и размножаться вне организма, но и дифференцироваться, приобретая важные черты специализации. Например, клетки сердечной мышцы в клеточной культуре могут сокращаться.
Для получения клеточной культуры небольшие кусочки ткани диссоциируют на отдельные клетки, используя ферментативную и механическую обработку, и получают суспензию клеток. Затем клетки помещают в специальные сосуды с плоским дном: стеклянные или пластиковые, и заливают искусственной питательной средой. Для каждого типа клеток среда индивидуальна. Для большинства животных клеток питательная среда имеет в своем составе глюкозу, незаменимые аминокислоты, витамины и небольшой процент сыворотки крови. Важно поддерживать нейтральную реакцию среды, оптимальную температуру, не допускать инфекционного заражения. В таких условиях клетки осаждаются на дно сосуда культивирования, прикрепляются к стеклу, распластываются на нем, приобретают характерную для них форму и начинают делиться. Через несколько суток вся поверхность дна сосуда становится заполненной клетками. Наступает момент контактного торможения, клетки прекращают делиться. Нормальные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии. Для дальнейшего культивирования их собирают из первого сосуда и переносят в несколько других сосудов в тех же условиях. Цикл повторяется заново. Так получают перевиваемые клеточные культуры.
Именно с помощью метода клеточных культур впервые были описаны особенности опухолевых клеток. Первая особенность – способность к бесконечному делению. В 50-е гг. XX в. была получена перевиваемая клеточная культура раковых клеток опухоли молочной железы. Культура получила название HeLa по первым буквам имени оперированной пациентки. Эти клетки живы до сих пор, и с ними работают во многих лабораториях мира. За прошедшие годы ученые вырастили тонны этих клеток, хотя самой пациентки давно уже нет в живых.
Другая особенность раковых клеток: они не прекращают делиться, заполняя всю поверхность сосуда. Клетки наползают друг на друга, могут образовывать второй и третий слой.
Нетрансформированные нормальные клетки могут делиться ограниченное количество раз. Такую культуру нельзя поддерживать бесконечно долго. После нескольких пересевов клетки перестают делиться и погибают.
Работа с клеточными культурами дает большие возможности для исследователей. На ранних этапах развития цитологии клеточные культуры использовали для визуального наблюдения за живыми клетками. Изучали процессы митоза, движения клеток, образования контактов между клетками. Сейчас на клеточных культурах изучают процессы дифференцировки, получают перевиваемые клеточные линии стволовых эмбриональных клеток. Клеточные культуры используют для моделирования различных патологических состояний: ишемии, химического или гормонального стресса, для переноса чужеродной генетической информации и т. д. Клеточные культуры находят широкое практическое применение для получения специфических антител, ферментов, факторов регуляции жизнедеятельности клеток, их используют при разработке вакцин.
Из клеточных культур растений можно вырастить целые организмы, поэтому их используют для создания новых сортов растений, обладающих важными для человека свойствами.
Вопросы
1. Как получают перевиваемые клеточные культуры?
2. Какие особенности раковых клеток были изучены в клеточной культуре?
3. Для чего используются клеточные культуры?
Конфокальная микроскопия
Широкий интерес к конфокальной микроскопии появился в конце XX в. благодаря бурному развитию компьютерной и лазерной технологий. Конфокальный микроскоп – это оптико-электронный прибор. В его основе лежит люминесцентный микроскоп, где объект освещается лазерным лучом и полученное изображение обрабатывается с использованием памяти компьютера. За счет такого приема можно воссоздать объемное изображение объекта при исследовании серии оптических срезов. Изображение создается на экране компьютера. Разрешение микроскопа увеличивается по сравнению с обычным люминесцентным микроскопом примерно в 1,5 раза. Основное достоинство конфокального микроскопа – не рост разрешающей способности, а существенное увеличение контрастности изображения.
Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследований в четырех измерениях: высота, ширина, глубина и время.
В таком микроскопе используются принципы люминесцентной микроскопии и иммуноцитохимии с применением специальных флюорохромов для конфокальных микроскопов. Помимо флюоресцентного конфокального изображения, в микроскопе можно получить соответствующее ему изображение образца в проходящем свете.
Использование конфокального микроскопа позволяет локализовать отдельные гены в структуре интерфазного ядра; изучать одновременно два или более белков, помеченных разными антителами, чтобы понять существует ли функциональная связь между ними; исследовать динамические процессы в клетке, в том числе и транспорт веществ через мембраны.
Благодаря использованию научно-технических достижений XX и XXI вв. в цитологии были разработаны новые методы, позволившие перейти на новый молекулярный уровень исследований с возможностью изучения не только структур клетки, но и молекул, выполняющих разнообразные функции.
Вопросы
1. Опишите принцип устройства конфокального микроскопа.
2. Каково его разрешение?
3. Для чего используется конфокальный микроскоп?
Глава 3. Химическая организация клетки
Живая клетка состоит из ограниченного набора химических элементов, хотя количество их велико. На долю шести элементов приходится более 99 % от сухой массы клеток. Это углерод, водород, азот, кислород, фосфор и сера (C, H, N, O, P, S). Это главные компоненты всех органических соединений клетки.
Химическое соединение, которое в максимальном количестве представлено в клетке, – вода. Практически все внутриклеточные реакции протекают в водной среде. Вода составляет более 70 % клеточной массы.
В растворенном виде в цитоплазме находятся малые органические молекулы, в состав которых входят четыре основных химических элемента, – C, H, O и N. Например, аминокислоты, простые сахара, нуклеотиды и предшественники жирных кислот. Эти молекулы дают начало макромолекулам: нуклеиновым кислотам, белкам, полисахаридам, жирным кислотам. Кроме того, малые молекулы могут расщепляться в клетке до простых соединений, и энергия их химических связей будет использоваться клеткой для многих процессов жизнедеятельности. Так, глюкоза в процессе окисления расщепляется до углекислого газа и воды. Освободившаяся энергия аккумулируется в форме двух важнейших соединений клетки – АТФ и НАД·Н.
Простые сахара используются клеткой для построения сложных полисахаридов, которые являются запасными веществами. В животной клетке вещество запаса гликоген, а в растительной – крахмал. Мономером этих веществ служит глюкоза. Целлюлоза, главный компонент оболочки растительных клеток, тоже является полимером, построенным из простых сахаров.
Аминокислоты являются строительным материалом для синтеза гигантских линейных полимеров – белков. В белках обычно встречается 20 разных аминокислот. Все аминокислоты имеют общую особенность в строении молекул: карбоксильную группу (-СООН) и аминогруппу (-NH2), связанные с одним и тем же углеродным атомом.
