Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии - Коллектив авторов

Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии

УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТ-пара – пара нуклеотидов аденин – тимин

АТФаза – аденозинтрифосфатаза

ГАМК – гамма-аминомасляная кислота

ГДК – глутаматдекарбоксилаза

ГЦ-пара – пара нуклеотидов гуанин – цитозин

дцДНК – двухцепочечная

ДНК ММ – молекулярная масса

НК – нуклеиновые кислоты

оцДНК – одноцепочечная

ДНК ПЦР – полимеразная цепная реакция

РНК – рибонуклеиновая кислота

СФ – синаптофизин

ФСБ – фосфатно-солевой буфер

ФЭУ – фотоэлектронный умножитель

ЦПМ – цитоплазматическая мембрана

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

ЭФР – эпидермальный фактор роста

5-TAMRA – 5-carboxytetramethylrhodamine

CCD-матрица (ПЗС-матрица) – charge-coupled device (прибор с зарядовой связью)

DABCO – диазобициклооктан

DAPI – 4,6-диамидино-2-фенилиндол

DMD – digital micromirror device (цифровые микрозеркальные устройства)

EB – этидия бромид

FITC – флуоресцеинизотиоцианат

FLAP – Fluorescence Localization After Photobleaching (локализация флуоресценции после фотоотбеливания)

FLIM – fluorescence lifetime imaging microscopy (микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции)

FLIP – Fluorescence Lossin Photobleaching (потеря флуоресценции во время фотоотбеливания)

FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleachin (восстановление флуоресценции после фотоотбеливания)

FRET – Fдrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии)

GPDH – глицерофосфатдегидрогеназа

LDH – лактатдегидрогеназа

PBFI – potassium-binding benzofuran isophtalate

PPI – пропидия йодид

PPDA – парафенилендиамин

RITC – родаминизотиоцианат

SBFI – sodium-binding benzofuran isophtalate

SDS – додецилсульфат натрия

SHIM – Second-harmonic imaging microscopy (микроскопия с использованием регистрации второй гармоники)

SNAP25 – Sy Naptosomal-Associated Protein, 25 kD

SNARE – Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor

TRITC – тетраметилродамин-5(6) – изотиоцианат

ПРЕДИСЛОВИЕ

В последние годы благодаря достижениям квантовой физики, молекулярной биологии и иммуноцитохимии, классические морфологические дисциплины приобрели совершенный инструмент для молекулярного анализа клеточных и тканевых структур. Сейчас можно констатировать, что на основе всестороннего использования новых молекулярных подходов происходит выделение передового направления в морфологии – молекулярной морфологии. Молекулярная морфология, аккумулируя знания, накопленные классической гистологией, эмбриологией, и патологической анатомией, способна занять ключевое место в интеграции клеточной биологии, биохимии, физиологии, молекулярной генетики и протеомики при решении фундаментальных проблем и прикладных задач биомедицинских исследований. Молекулярная морфология, используя постоянно расширяющиеся возможности новых методов конфокальной микроскопии, а также оптической микроскопии сверхвысокого разрешения, в скором времени должна решить насущную задачу создания нового поколения методов трехмерного молекулярного анализа клеточных и тканевых структур, пригодных для использования не только в практике научного исследования, но и в диагностических целях. Ожидаемые новые методы должны быть просты, надежны в использовании, высокоселективны и высокочувствительны. Успешное решение поставленной задачи требует от исследователя глубоких знаний о современных методических приемах иммуноцитохимии, флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Одной из важных задач, стоящих перед морфологом, занимающимся научными исследованиями, является участие в комплексных исследовательских программах, объединяющих специалистов разного профиля с целью решения конкретной научной проблемы. Квалифицированному специалисту-морфологу для успешного выполнения задач комплексных междисциплинарных исследований уже недостаточно владения только основами общей, частной морфологии и патологии, но требуется также и понимание главных биофизических принципов, лежащих в основе феноменов, используемых при создании приборов, предназначенных для флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Без этого невозможно разобраться в сложных настройках современных приборов, от правильного использования которых зависит окончательный результат кропотливой подготовительной работы. Облегчить специалистам-морфологам и научным работникам смежных специальностей знакомство с новыми методами микроскопии и показать, как можно с их помощью решать различные задачи, связанные с изучением структур клеток и тканей, должна помочь настоящая книга.

Технической базой для реализации представленных в приложениях протоколов и иллюстраций, помещенных на вклейках, послужил комплекс оборудования и программного обеспечения, разработанный фирмой Zeiss (Германия), который включает конфокальные лазерные микроскопы LSM 710 и LSM 510 Meta. Иммуноцитохимические протоколы и общие принципы работы с конфокальным микроскопом универсальны и могут успешно использоваться с оборудованием любых производителей.

Настоящее руководство аккумулирует многолетний опыт сотрудников лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины, связанный с использованием методов конфокальной лазерной микроскопии и иммуноцитохимии.

Научные исследования, результаты которых использованы при написании этой книги, были выполнены при поддержке Российского научного фонда (проект № 14-15-00014).

Глава 1.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием метода фазового контраста, для двулучепреломляющих материалов применяют поляризационный контраст. Основным же методом контрастирования в биологии является окрашивание препаратов веществами, способными связываться с препаратом и поглощать свет или флуоресцировать. Последние называют флуорохромами.

1.1. Основные понятия

Флуорохромы (флуоресцентные красители)1 – это вещества, которые способны связываться с объектом и расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию. Под флуоресценцией понимают способность ряда веществ после поглощения света с одной длиной волны излучать свет с другой длиной волны. Напомним, что электроны в атомах расположены на энергетических уровнях; расстояние между уровнями является характеристикой молекулы. При облучении вещества светом возможен переход электронов на более высокий энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света связаны между собой уравнением Бора (постулат Бора):

где ΔЕ – разность энергий между уровнями; v – частота; λ – длина волны; h – постоянная Планка; с – скорость света.

После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в виде тепла, а часть может быть излучена в виде фотона. Согласно правилу Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого, или, другими словами, максимум спектра излучения сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн. С физическими основами описанных выше процессов более подробно можно ознакомиться в учебнике Р. Фейнмана (2011).

Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания. Например, один из самых распространенных флуоресцентных красителей – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – имеет максимум поглощения lex = 492 нм, а максимум излучения для него составляет lem = 518 нм. Другой распространенный флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), имеет lex = 543 нм и lem = 570 нм. На величину стоксова сдвига также влияет полярность среды, в которой находится флуорохром.

Наиболее интенсивной флуоресценции флуорохрома можно добиться, облучая его светом с длиной волны, близкой к максимуму поглощения, однако возможно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при облучении его светом с длиной волны, существенно отличающейся от его максимума поглощения. Например, флуорофор можно перевести в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами (мультифотонное возбуждение), что будет эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Так, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм.